大连自噬

在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度。MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔。不论自噬过程启动过慢还是过快，或者出现功能障碍，都将导致可怕的后果。大连自噬

Bcl-2家族蛋白在凋亡和自噬间起到关键性双重调控作用。它们可分为3个亚类：共有BH1-BH3结构域的促凋亡执行蛋白Bax、Bak；共有BH1-BH4结构域的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1；只有BH3结构域的促凋亡蛋白Bad、Noxa、BNIP3、Bid、Bim、Puma等。抗凋亡蛋白Mcl-1降解被发现是自噬唤醒的早期事件。而Beclin-1是迄今发现的唯独与酵母自噬基因同源的哺乳动物自噬基因，被证实也是一种BH3-only蛋白，可与Bcl-2抗凋亡蛋白结合直接调控自噬和凋亡。当它与Bcl-2/Bcl-xL结合构成Beclin-1:Bcl-2/Bcl-xL复合体时可阻止Beclin-1唤醒自噬，但当Bcl-2促凋亡蛋白竞争性结合Bcl-2/Bcl-xL时则Beclin-1被释放诱发自噬。Beclin-1依赖性调节自噬的另一机制是通过caspase-3剪切Beclin-1而阻止自噬。其它BH3-only促凋亡蛋白如Bad、BNIP3、Puma和BH3结构域模拟物也被发现可通过竞争性结合Bcl-2/Bcl-xL释放Beclin-1，诱导自噬。细胞自噬Beclin1自噬可以降解和消化受损、变性的细胞器、蛋白质与核酸等生物大分子。

自噬在饥饿、低氧、药物等因素作用下，待降解的细胞成分周围会形成双层结构分隔膜，随后分隔膜逐渐延伸，较终将待降解的胞浆成分完全封闭形成自噬体；自噬体形成后将通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，二者融合形成自噬溶酶体；较终其内容物在溶酶体酶作用下被细胞降解利用。目前研究发现自噬调节涉及多种信号通路，其中以腺苷单磷酸活化蛋白激酶及哺乳动物雷帕霉素受体信号通路为调控中心。AMPK促进自噬发生，而mTOR阻止自噬发生。此外，许多经典的凋亡信号通路或蛋白被发现与自噬调控之间存在着复杂的交织。

发现自噬基因：大隅良典接着利用了他改造过的酵母菌株——在这些酵母挨饿时，它们的自噬体会积累起来。如果对自噬过程重要的基因被失活，那么自噬体积累就理应不会发生。大隅良典将酵母细胞暴露在一种能随机在多个基因里引起突变的药物中，然后诱导自噬过程。他的策略奏效了！在他发现酵母自噬一年内，大隅良典就鉴定出了第1批对自噬至关重要的基因。在接下来的众多巧妙研究中，他对这些基因所编码的蛋白质的功能进行了研究。结果显示，自噬过程是由大量蛋白质和蛋白质复合物所控制的。每种蛋白质负责调控自噬体启动与形成的不同阶段。自噬过程与内涵体途径密不可分。

在荧光显微镜下采用GFP-LC3单荧光体系/mRFP-GFP-LC3双荧光体系等融合蛋白来示踪自噬形成：GFP-LC3单荧光自噬指示体系：利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定表示自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过westernblot检测游离的GFP、p62来验证。自噬作用对维持细胞体内平衡和能量平衡至关重要。青岛wb检测自噬

自噬性溶酶体是一种自体吞噬泡,作用底物是内源性的,即细胞内的蜕变、破损的某些细胞器或局部细胞质。大连自噬

自噬过程的调控：从自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前，已经报告了比较多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物传染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等比较多问题都还在等待进一步解答中。大连自噬

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